Islak Preparattan Gram ve Asit-Fast Boyamaya
Bakteriler, boyasız (ıslak preparat) ya da boyanmış preparat halinde incelenebilir. Islak preparat, ışık mikroskobuyla bakterilerin hareketliliğinin (motilite) gösterilmesi veya karanlık alan (dark-ground) mikroskobuyla spiroketlerin gösterilmesi için yararlıdır. Boyanmış preparatlar ise bakterilerin yapısal ayrıntılarını, renk kontrastı oluşturarak göstermek amacıyla kullanılır.
Boyasız (Islak) Preparat ve Boyanmış Preparat
- Islak preparat: Işık mikroskobunda bakterilerin motilitesini göstermek veya karanlık alan mikroskobunda spiroketleri göstermek için yararlıdır.
- Boyanmış preparat: Bakterilerin yapısal ayrıntılarını, renk kontrastı oluşturarak göstermek için kullanılır.
Anahtar bilgi: Islak preparat “hareketi ve canlı morfolojiyi”, boyalı preparat ise “kontrast ve ayrıntıyı” öne çıkarır; hangi hazırlığın seçileceği, gösterilmek istenen özelliğe göre belirlenir.
Boyama Yöntemleri
Tanısal mikrobiyolojide kullanılan yaygın boyama teknikleri aşağıda ele alınmıştır:
Basit boyalar
Metilen mavisi ve bazik fuksin, sürüntüdeki tüm bakterilere aynı rengi veren ancak renk kontrastı sağlayan basit boyalardır.
Negatif boyama
Bakteriler, Hindistan mürekkebi gibi, boyanmamış organizmaların kontrastla belirginleştiği uniform koyu renkli bir arka plan oluşturan boyalarla karıştırılır. Bu yöntem, basit boyalarla genellikle boyanmayan bakteriyel kapsülün gösterilmesinde kullanılır. Mantar Cryptococcus neoformans’ın gösterilmesi için Hindistan mürekkebi yöntemi yaygın bir örnektir.
İmpregnasyon boyaları
Işık mikroskobuyla görülemeyecek kadar ince olan hücreler ve yapılar, yüzeylerine gümüşün impregnasyonu ile görünür hale getirilebilir. Gümüş impregnasyon yöntemi, T. pallidum, Leptospira, Borrelia vb. spiroketlerin boyanmasında kullanılan yaygın bir yöntemdir.
Diferansiyel boyalar
Diferansiyel boyalar, farklı bakterilere veya farklı bakteriyel yapılara farklı renkler verir. Yaygın kullanılan diferansiyel boyalar arasında Gram boyası, asit-fast boyası ve Albert boyası yer alır.
Anahtar bilgi: Basit boyalar genel kontrast sağlar; negatif boyama kapsül gibi zor boyanan yapıları öne çıkarır; impregnasyon ince yapıları görünür kılar; diferansiyel boyalar ise tanısal ayrım için temel bir araçtır.
Gram Boyama
Gram boyama, Danimarkalı mikrobiyolog Christian Gram tarafından 1884 yılında bakterilerin sınıflandırılması için pratik bir yöntem olarak geliştirilmiştir.
Gram boyama yöntemi temelde dört basamaktan oluşur:
- Metil viyole, kristal viyole vb. bazik boyalarla primer boyama.
- İyodun seyreltilmiş çözeltisi şeklinde mordan uygulanması.
- Etanol, aseton veya anilin ile dekolorizasyon.
- Karbol fuksin, safranin veya nötral kırmızı gibi asidik boyalarla karşı boyama.
Anahtar Noktalar
Gram boyama, bakterilerin tanımlanmasında kullanılan temel bir işlemdir. Boya, bakterileri iki geniş gruba ayırır:
- Gram-pozitif bakteriler, dekolorizasyona direnç gösterir ve primer boya-iyot kompleksini tutarak viyole görünür. Nispeten kalın amorf bir duvara ve bazik viyole boya ile iyot kompleksini hücre içinde tuttuğuna inanılan daha asidik bir protoplazmaya sahiptirler.
- Gram-negatif bakteriler, organik çözücülerle dekolorize olur ve karşı boyayı alarak kırmızı görünür. Boyama sırasında kullanılan aseton veya etanol gibi dekolorize edici ajan, bu membranöz zarfı bozar ve boya ile iyot kompleksi Gram-negatif bakterilerden yıkanarak uzaklaşır.
Mycobacterium tuberculosis ve Mycobacterium leprae gibi bazı bakteri grupları, tipik Gram-negatif veya Gram-pozitif bakteriler olarak değerlendirilemez. Bunun nedeni, bu bakterilerin Gram boyayı ya hiç almaması ya da farklı bir zarf tipine sahip olmasıdır. Bu mikobakteriler, Gram boyaya geçirimsiz olmalarını sağlayan kompleks glikolipidler içeren mumsu bir zarfa sahiptir. Gram boyama, bakteriyel hücre duvarının yapısı hakkında da yararlı bilgi sağlar.
Anahtar bilgi: Gram boyama, yalnızca “renk farkı” üretmez; aynı zamanda hücre duvarı özellikleri hakkında ipucu vererek tanısal yaklaşımı yönlendirir.
Asit-Fast Boyama (Ziehl–Neelsen, ZN)
Asit-fast boyama, Ehrlich tarafından keşfedilmiştir; Ehrlich, anilin boyaları ile boyandıktan sonra tüberkül basillerinin asitle dekolorizasyona direnç gösterdiğini saptamıştır. Yöntem daha sonra Ziehl ve Neelsen tarafından modifiye edilmiş ve bu nedenle yaygın olarak Ziehl–Neelsen (ZN) boyası olarak bilinmiştir.
Anahtar Noktalar
Asit-fast boyama yöntemi aşağıdaki basamaklardan oluşur:
- Fikse sürüntüler, ısı uygulanarak güçlü bir karbol fuksin ile önce boyanır. Isıtma, fenolik karbol fuksin boyasının bakteriye girişini kolaylaştırır.
- Daha sonra %5–20 (boyanacak bakteriye bağlı olarak) sülfürik asit ile dekolorize edilir.
- Ardından metilen mavisi gibi kontrast bir boya ile karşı boyama yapılır. Asit-fast basiller (AFB), karbol fuksinin kırmızı rengini tutar ve boyalı sürüntülerde parlak kırmızı görünür. Sürüntüde bulunan irin hücreleri ve epitel hücreleri ise karşı boyanın mavi rengini alır ve mavi görünür.
Asit-fastlık; (a) hücre duvarında bulunan lipidlerin, yağ asitlerinin, mikolik asit bileşenlerinin yüksek içeriğine ve (b) daha yüksek alkollere bağlıdır. Asit-fastlık ayrıca hücre duvarının bütünlüğüne de bağlıdır.
ZN sürüntüsü en iyi şu etkenlerin boyanmasında kullanılır:
- M. tuberculosis, M. leprae, Nocardia, Actinomyces ve
- İntestinal koksidiyen parazitlerin ookistleri (ör. Cryptosporidium, Cyclospora, Isospora vb.).
Anahtar bilgi: ZN boyamada ısı uygulaması, karbol fuksinin hücre zarfına girişini kolaylaştırır; asit-fast görünüm ise özellikle mikobakterilerin “mumsu” zarf bileşenleriyle ilişkilidir.
Albert Boyası
Albert boyası, C. diphtheriae’nin volutin granüllerinin boyanmasında kullanılır. Bu granüller bazik boyalara afinite gösterir ve metakromatik granüller olarak adlandırılır. Albert boyası ile boyandığında, yeşil protoplazma üzerinde mavimsi-siyah renkli granüller olarak görülür.
Anahtar bilgi: Albert boyası, özellikle metakromatik granüllerin görünür hale getirilmesiyle tanısal değerlendirmeye katkı sağlar.